Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

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NMR Untersuchung der Proteinfaltung

Die Proteinfaltung beschäftigt sich mit der Frage,  wie die entfaltete Polypeptidkette eines Proteins in die native,  biologisch aktive Konformation übergeht. Hierzu untersuchen wir den  entfalteten Zustand und Faltungsintermediate im chemischen Gleichgewicht  mit dem nativen Zustand. Besonders aussagekräftig sind hier  Amidprotonenaustauschexperimente, da diese eine Untersuchung der lokalen  Stabilität zulassen sowie deren Änderung bei der Faltung oder der  Substratbindung. Mit diesen Methoden konnte der Faltungsmechanismus der ankyrin repeat Proteine P19INK4d und tANK sowie von Barstar und Onconase charakterisiert werden.

Da wir in Lösung arbeiten, können strukturbiologische Untersuchungen von  Proteinreaktionen mittels zeitaufgelöster NMR durchgeführt werden. Zum  Beispiel konnten wir die Substratbindung des Enzyms SlyD auf  molekularer Ebene untersuchen.

<sup>1</sup>H NMR-Spektroskopie: Rückfaltungskinetik von Ribonuklease T1, welches das Proteinsubstrat der Prolylisomerase SlyD darstellt.

1H NMR-Spektroskopie: Rückfaltungskinetik von Ribonuklease T1, welches das Proteinsubstrat der Prolylisomerase SlyD darstellt.

1H NMR-Spektroskopie: Rückfaltungskinetik von Ribonuklease T1, welches das Proteinsubstrat der Prolylisomerase SlyD darstellt.

Unser besonderes Augenmerk liegt auf der Strukturuntersuchung von transienten Faltungsintermediaten. Im Falle von humanem P19INK4d und dem Gen-3-Protein  von fd Phagen konnten wir zeigen, dass diese transienten Zustände eine wichtige Funktion der Proteine darstellen. Der infektiöse Zustand des Gen-3-Protein ist nicht etwa der gefaltete, thermodynamisch stabilste Zustand, sondern ein Faltungsintermediat. Die Inhibition von CDK4/6 im humanen Zellzyklus durch P19INK4d wird über die unterschiedliche Stabilität der einzelnen ankyrin repeats geregelt, was wir durch Strukturuntersuchungen transienter Intermediate aufdecken konnten.

Regulationsmechanismus der Inhibition der CDK4/6 durch P19<sup>INK4d</sup>, dessen wenig stabile ankyrin repeats (grün) durch Phosphorylierung entfalten.

Regulationsmechanismus der Inhibition der CDK4/6 durch P19INK4d, dessen wenig stabile ankyrin repeats (grün) durch Phosphorylierung entfalten.

Regulationsmechanismus der Inhibition der CDK4/6 durch P19INK4d, dessen wenig stabile ankyrin repeats (grün) durch Phosphorylierung entfalten.

Schnelle Faltungsreaktionen, im Mikro- bis Sekundenbereich, beeinflussen die Relaxationseigenschaften der NMR-aktiven Kerne. Damit ist es möglich, über die Dispersion der transversalen Relaxationsraten z.B. der 15N Kerne, lokale und globale Faltungsreaktionen in diesem Zeitfenster zu bestimmen.

R<sub>2</sub>-Dispersionskurve von Gly 57 des Kälteschockproteins CspB aus <i>B. subtilis</i>. Daraus lassen sich die Faltungsrate (k<sub>f</sub> = 1020 s<sup>-1</sup>) und Entfaltungsrate (k<sub>u</sub> = 12 s<sup>-1</sup>) bestimmen.

R2-Dispersionskurve von Gly 57 des Kälteschockproteins CspB aus B. subtilis. Daraus lassen sich die Faltungsrate (kf = 1020 s-1) und Entfaltungsrate (ku = 12 s-1) bestimmen.

R2-Dispersionskurve von Gly 57 des Kälteschockproteins CspB aus B. subtilis. Daraus lassen sich die Faltungsrate (kf = 1020 s-1) und Entfaltungsrate (ku = 12 s-1) bestimmen.

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