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Zeitaufgelöste Fluoreszenztomographie

Investigators: Franz-Josef Schmitt, Fabian
Rieder

Die Abbildung zeigt eine Lebensdauer-Kurve der pH-Werte in einer Mikrotiterplatte, die mit zeitaufgelöster Fluoreszenztomographie und pH-empfindlichen Markermolekülen (Fluoresceinisothiocyanat, FITC) bestimmt wurden.

Die Gruppe untersucht die zeitaufgelöste Fluoreszenztomographie (FT) zur dreidimensionalen Visualisierung fluoreszierender Gewebe mit quantitativer Tiefenempfindlichkeit. Ein Ziel ist die Bestimmung des lokalen pH-Wertes durch die Kombination von zeitaufgelöster Fluoreszenz mit pH-empfindlichen Markermolekülen.

Bei der FT wird das Gewebe angeregt – typischerweise im nahen Infrarotbereich – und die resultierende Emission wird an mehreren Oberflächenpositionen und Betrachtungswinkeln aufgezeichnet. Spezifische Fluoreszenzmarker mit pH-abhängiger Fluoreszenzlebensdauer können verwendet werden, um eine 3D-pH-Karte des Gewebes auf der Grundlage der lokalen Fluoreszenzlebensdauer zu erstellen (siehe Abb.).

Die Fluoreszenzlebensdauer ist weitgehend unabhängig von der Chromophorenkonzentration und wird nur geringfügig durch autofluoreszierende Signale verzerrt, sodass sie einen viel besseren Maßstab für den pH-Wert darstellt als intensitätsbasierte Messungen.

Die Leistung wird anhand von gewebeähnlichen Phantomen und Ex-vivo-Proben bewertet, um die räumliche Auflösung, die Empfindlichkeit, das Kontrast-Rausch-Verhältnis und die absolute Konzentrationsgenauigkeit zu quantifizieren.

Fluoreszierende Moleküle in der Krebsdiagnostik

Investigator: Franz-Josef Schmitt

Die Abbildung zeigt, dass gezielte Mutationen fluoreszierende Proteine durch Optimierung der Chromophorstabilisierung, der Chromophor-Wasser-Wechselwirkung und des Protonentransfers im angeregten Zustand für helle Sensoren mit starker pH-Empfindlichkeit verbessert haben.

Wir analysieren die pH-Abhängigkeit von weitrot fluoreszierenden Proteinen, indem wir Breitband-Absorptions-/Emissionsspektroskopie mit mehrkanaliger zeitkorrelierter Einzelphotonen-Zählung (TCSPC) und Decay-Associated-Spectra (DAS)-Analyse koppeln. An die DAS angepasste kinetische Modelle zeigen die pH-Abhängigkeit intramolekularer Relaxationskanäle und helfen, die Wechselwirkung der Moleküle mit Protonen zu verstehen und das spezifische Design optimierter pH-Sensoren zu unterstützen.

Molekulardynamik (MD) bei verschiedenen Protonierungszuständen rationalisiert die beobachtete Photophysik und ermöglicht ein Verständnis der Rolle spezifischer Aminosäuren bei der Stabilisierung des Chromophors und der Modulation der Effizienz des Protonentransfers im angeregten Zustand (ESPT), wodurch eine mechanistische Grundlage für pH-sensitive Lebensdauer- und Unempfindlichkeitsmessungen geschaffen wird.

Insgesamt verbindet der kombinierte Spektroskopie-Modellierungs-MD-Rahmen die intramolekulare Wasser-/Chromophor-Dynamik mit ESPT-gesteuerten Raten und legt Designregeln für pH-Biosensoren aus rot fluoreszierendem Protein fest, die mit lebensdauerbasierten Auslesungen, superauflösender/ultraschneller Fluoreszenzmikroskopie und Pump-Probe-Photoakustik-Berichterstattung in vivo kompatibel sind (siehe Abb.).