var _gaq = _gaq || []; _gaq.push(['_setAccount', 'UA-42425265-1']); _gaq.push(['_trackPageview']); (function() { var ga = document.createElement('script'); ga.type = 'text/javascript'; ga.async = true; ga.src = ('https:' == document.location.protocol ? 'https://ssl' : 'http://www') + '.google-analytics.com/ga.js'; var s = document.getElementsByTagName('script')[0]; s.parentNode.insertBefore(ga, s); })(); Conclusions

1.      Обнаружена анизотропия броуновского вращения глобулярных белков в водных растворах, вызываемая взаимным ориентированием белков за счет электростатических взаимодействий.

Методами ЯМР-релаксации, диэлектрической спектроскопии и моделирования броуновской динамики обнаружена сложная форма корреляционной функции, свидетельствующая об анизотропии броуновского вращения белков. Параметры этой анизотропии различны для разных белков и зависят от концентрации, рН и ионной силы раствора. Для объяснения этого эффекта предложена модель броуновского движения белков, учитывающая взаимодействие электрического дипольного момента белка с электрическим полем, создаваемым ближайшими белковыми молекулами. Это взаимодействие вызывает анизотропию вращения, время жизни которой определяется трансляционной диффузией белков друг относительно друга. Данная модель позволяет на качественном уровне объяснить все наблюдаемые в эксперименте особенности броуновского вращения белков, вызываемые межмолекулярными взаимодействиями. Этот результат диссертации вошел в перечень важнейших результатов Российской Академии Наук в области естественных, технических, гуманитарных и общественных наук за 1997 год. Подробное изложение - во второй главе диссертации.

2.      Установлено, что внутренняя динамика глобулярных белков в кристаллическом и аморфном (регидратированный лиофильно высушенный порошок) состояниях в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции одинакова.

С помощью измерения спин-решеточной релаксации в лабораторной и вращающейся системах координат на ядрах 13С естественного содержания был проведен сравнительный анализ молекулярной динамики в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции для трех различных белков (лизоцим белка куриных яиц, лизоцим Т4 и барстар) в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях. Визуальное сравнение релаксационных спадов для всех трех белков показало, что внутренняя динамика как основной, так и боковых цепей в двух состояниях одинакова. Этот результат важен в связи с обсуждающимся в литературе вопросом о корректности применения твердотельных экспериментов для объяснения биологических свойств белка в растворе. Идентичность динамических параметров белка в порошке и кристалле говорит о том, что межбелковые взаимодействия, если белки не образуют специфических комплексов, не оказывают заметного влияния на внутреннюю динамику, в отличие от уровня гидратации, который имеет для белков большое значение. Данный результат является косвенным свидетельством того, что внутренняя динамика глобулярного белка в твердом гидратированном состоянии и в растворе тоже одинакова. Подробное изложение – в части 3.2 диссертации.

3.      Разработаны способы определения физических моделей молекулярной динамики, основанные на одновременном количественном анализе степеней усреднения различных магнитных взаимодействий.

Одной из основных методических проблем исследования молекулярной динамики методом ЯМР является невозможность однозначного построения физической модели движения из определяемой в эксперименте степени усреднения (параметра порядка) того или иного магнитного взаимодействия. Эту проблему предложено решать путем сопоставления степеней усреднения различных взаимодействий, которые экспериментально измеряются на одном и том же образце. Такой сопоставительный количественный анализ данных ЯМР-экспериментов различного типа позволяет делать обоснованный выбор в пользу той или иной модели движения непосредственно из эксперимента. Данный подход был продемонстрирован двумя разными способами. В полилизине с помощью протонной и углеродной ЯМР-спектроскопии исследовалось движение межъядерных векторов 1Н-1Н и 1Н-13С. Совместный анализ протонных и углеродных данных позволил констатировать наличие в полилизине трех различных динамических процессов и наглядно представить их физические модели. Другой способ реализации этого подхода заключается в одновременном проведении релаксационных и обменных экспериментов (подход SREDA), что позволяет сопоставлять движение межъядерного вектора и тензора анизотропии химического сдвига. Хотя данный метод позволяет определять модели только для высокоамплитудных движений, даже при низких амплитудах динамики совместный анализ обменных и релаксационных данных позволяет проводить гораздо более точную и однозначную количественную характеристику движений по сравнению с анализом этих данных по отдельности. Это было продемонстрировано при изучении динамики основной цепи барстара. Подробное изложение – в частях 3.3.3 и 3.4.2 диссертации.

4.      Установлено, что определяющую роль в молекулярном механизме влияния гидратации на внутреннюю конформационную динамику белков играет соотношение между стерической доступностью элементов структуры белка для молекул воды и наличием сети водородных связей, стабилизирующих вторичную структуру.

Данный вывод получен из сравнительного анализа гидратационной зависимости параметров внутренней динамики куриного лизоцима и полилизина, который был проведен с помощью релаксационной ЯМР-спектроскопии на ядрах 13С естественного содержания. Показано, что при увеличении гидратации полилизина значительно увеличивается подвижность боковых цепей, а подвижность основной цепи почти не изменяется. Важно отметить, что 80% основной цепи полилизина образует бета-слой и, следовательно, связано сетью водородных связей. Для лизоцима наблюдается обратная картина: плотная упаковка структуры не позволяет проникать молекулам воды внутрь структуры белка, и потому увеличение гидратации ведет только к слабому росту подвижности боковых цепей, в основном за счет поверхностных эффектов. А рост амплитуды низкочастотного движения основной цепи, наоборот, по сравнению с полилизином очень значителен. Причиной этой разницы является то, что только 40% основной цепи лизоцима образуют элементы вторичной структуры за счет образования сети водородных связей. Этот результат является шагом от феноменологического описания влияния гидратации на различные свойства белков к детальному анализу молекулярных механизмов этого влияния. Подробное изложение – в частях 3.3.1 и 3.3.2 диссертации.

5.      Разработаны две модификации ЯМР-эксперимента по измерению спин-решеточной релаксации во вращающейся системе координат в твердом теле, которые позволяют исключить нежелательный спин-спиновый вклад в релаксацию и существенно расширить частотный диапазон измерений.

Дополнительный т.н. спин-спиновый вклад в спин-решеточную релаксацию во вращающейся системе координат в твердых телах – принципиальное препятствие для широкого использования времен релаксации T1r в количественном исследовании молекулярной динамики жестких (био)полимеров. Для подавления этого вклада при измерении релаксации, обусловленной гетероядерным (в частности, 13С-1Н или 15N-1Н) диполь-дипольным взаимодействием, предложены две модификации традиционного эксперимента по измерению T1r: 1) использование отстройки от резонанса поля спин-лока, что позволяет значительно увеличивать амплитуду спин-лока без увеличения мощности передатчика; 2) использование дипольной развязки от протонов во время действия спин-лока на частоте ядер 13С или 15N. Эти эксперименты были опробованы на модельных системах, и было показано, что они, во-первых, позволяют подавить спин-спиновый вклад в релаксацию и, во-вторых, существенно расширить частотный диапазон релаксационных измерений. Эти модификации явились основой для проведения последующих количественных исследований молекулярной динамики нескольких биополимеров. Подробное изложение – в части 3.1 диссертации.

6.      Обнаружена зависимость скорости спиновой диффузии между ядрами 15N от частоты вращения образца под магическим углом.

Эксперименты по измерению скорости спиновой диффузии между ядрами 15N в тотально обогащенных белке (лизоцим Т4) и поликристаллическом ВОС-глицине, проведенные с помощью одномерной обменной ЯМР-спектроскопии (импульсная последовательность CODEX) показали, что характерное время спиновой диффузии между ядрами 15N линейно растет с ростом частоты ВМУ. Учет этого эффекта важен для осознанного выбора частоты ВМУ при проведении экспериментов, в которых спиновая диффузия может быть как полезным (структурные и корреляционные эксперименты), так и мешающим (динамические эксперименты) явлением. Определение абсолютных значений характерных времен спиновой диффузии в тотально обогащенном изотопом 15N белке показало, что даже при самых высоких экспериментально достижимых скоростях ВМУ спиновая диффузия быстрее, чем спин-решеточная релаксация большинства  ядер 15N основной цепи белка. Отсюда следует вывод о том, что получение селективной динамической информации с помощью измерения Т1 ядер 15N в тотально обогащенном белке невозможно, для этого необходимо проводить селективное изотопное обогащение. Подробное изложение – в части 3.4.3 диссертации.

7.      Экспериментально продемонстрирована возможность применения одномерной обменной ЯМР-спектроскопии твердого тела с ВМУ для исследования молекулярной динамики белков в миллисекундном диапазоне времен корреляции.

Одномерная твердотельная обменная ЯМР-спектроскопия была впервые применена для исследования параметров конформационной динамики основной цепи белка (барстара). Бело показано, что обменный эксперимент (импульсная последовательность tr-ODESSA) способен детектировать движения в белке со временем корреляции порядка миллисекунды. В то же время, анализ данных существенно затрудняет спиновая диффузия, которая накладывается на обменный процесс, связанный с молекулярным движением. На основании анализа обменной схемы, включающей в себя молекулярное движение и спиновую диффузию, было продемонстрировано, что молекулярное движение не может наблюдаться, если оно медленнее, чем спинованя диффузия. Подробное изложение – в части 3.4.1 диссертации.